Die zelluläre Analyse ist ein entscheidender Prozess, der darauf abzielt, den aktuellen Zustand von Zellen zu erfassen und zu bewerten. Dies umfasst die Beurteilung von Aspekten wie Zellintegrität, Toxizität und Überlebensfähigkeit, die für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen von Bedeutung sind.
Methoden der zellulären Bildgebung
Forschern stehen für die zelluläre Bildgebung diverse Methoden zur Verfügung. Diese reichen von der Phasenkontrast-Mikroskopie, die intakte Zellen abbildet, bis hin zum Fluoreszenz-Imaging, das in der Lage ist, einzelne Moleküle und Organellen darzustellen.
Grundlagen der Zellkultur und Vorbereitung
Die Protokolle für die Kultivierung, das Ausplattieren und die Pflege von Zellen variieren je nach verwendetem Zellmodell. Für die Analyse werden adhärente oder suspendierte Zellen in geeignete Laborgefäße, wie Kulturschalen, Kammerobjektträger oder Mikroplatten, ausgesät.
Anschließend werden die Zellen unter den üblichen Kulturbedingungen inkubiert, typischerweise bei 37°C und 5% CO2. Die Zugabe von Substanzen zu den Zellen kann je nach Wirkmechanismus der untersuchten Verbindung und der zu untersuchenden biologischen Antwort von wenigen Minuten bis zu mehreren Tagen erfolgen. Beispielsweise erfordern Assays zur Untersuchung von Apoptose oder Rezeptorinternalisierung in der Regel kürzere Inkubationszeiten, während multiparametrische Zytotoxizitäts-Assays längere Zeiträume benötigen.
Markierung von Zellen für die Analyse
Lebendzellen können mit einer Vielzahl von Fluorophoren gefärbt oder mit Konstrukten transfiziert/transduziert werden, die fluoreszierende Proteine oder Peptidfusionen enthalten. Bei der Färbung ist es wichtig, die Anweisungen des Herstellers zu befolgen. Eine Färbung ist jedoch nicht für alle Anwendungen mit Lebendzellen erforderlich.
Lösungen für High-Content-Screening und Analyse
Das Webinar befasst sich mit Anwendungen des High-Content-Screening (HCS), wie sie in der Virusforschung, bei Studien zum Neuritenauswuchs und für Organoidmodelle zum Einsatz kommen. Die angebotenen Lösungen für zelluläres Imaging können die erforderlichen Aufnahme- und Analysefunktionen bereitstellen, um den Bedürfnissen eines Forschungs- oder Screening-Labors gerecht zu werden, sei es ein High-Content- und High-Throughput-System oder ein einfach zu bedienendes System.
Assay-Kits und skalierbare Systeme
Es werden benutzerfreundliche, robuste Assay-Kits für die Life-Science-Forschung, die Wirkstoffforschung und -entwicklung sowie für Bioassays angeboten. Diese Kits sind für die Verwendung mit den entsprechenden Instrumenten optimiert. Systeme für High-Content-Imaging und -Analyse zeichnen sich durch eine flexible Skalierbarkeit aus, die es ermöglicht, das System parallel zur Forschung weiterzuentwickeln.
Software für die zelluläre Bildanalyse
Die Aufnahme von Bildern wird mit einer spezialisierten Imaging-Software für zelluläre Analysen ausgewertet, um multiparametrische Ergebnisse für die erforschten biologischen Reaktionen zu generieren. Die MetaXpress® Software für High-Content-Bilderfassung und -analyse ist eine umfassende Lösung, die einen strukturierten und integrierten Arbeitsablauf bietet. Das Portfolio an Anwendungsmodulen deckt eine breite Palette von Anforderungen ab, von der einfachen Handhabung bis hin zum individuellen Assay-Design. Diese Software beinhaltet leistungsstarke Werkzeuge für das 2D- und 3D-Imaging, einschließlich der Zeitrafferanalyse.
Bedeutung der Zellfunktionsanalyse
Ein umfassendes Verständnis der Zellfunktionen ist für den Fortschritt der Forschung von entscheidender Bedeutung. Durch die Aufklärung der Mechanismen, die dem zellulären Verhalten zugrunde liegen, können Forscher neue Erkenntnisse über verschiedene biologische Prozesse gewinnen, was den Weg für Fortschritte in Medizin, Biotechnologie und anderen Bereichen ebnet.
Vielfalt an Assays und Reagenzien
Thermo Fisher Scientific bietet eine breite Palette von Assays und Reagenzien zur Untersuchung von Schlüsselprozessen in Zellen an, darunter Apoptose, Zellproliferation, Zellzyklus und Viabilität, oxidativer Stress, Internalisierungsprozesse wie Phagozytose und Endozytose sowie Indikatoren für die Ionenhomöostase.
Spezifische Assay-Kategorien:
- Autophagie-Forschungs-Assays: Diese Assays dienen der Überwachung des Fortschritts der Autophagie, bei der Zellen beschädigte oder defekte Moleküle verdauen oder vorhandene Proteine und Organellen abbauen, um Nährstoffe für das Überleben zu gewinnen.
- Zytotoxizitäts-Assays: Zytotoxizität kann mithilfe von Assays überwacht werden, die Veränderungen in der Viabilität, Proliferation, mitochondrialen Funktion, Phospholipidose/Steatose, DNA-Schäden und dem Zellzyklus messen.
- Ionenindikator-Assays: Es wird eine breite Palette fluoreszierender Farbstoffe und Sonden angeboten, einschließlich Indikatoren für Calcium, Magnesium, Natrium, Kalium, pH-Wert und Membranpotenzial.
Zellzählung und ihre Bedeutung
Die Fähigkeit zur Quantifizierung von Zellzahlen in Multiwell-Mikroplatten ermöglicht eine Vielzahl biologischer Anwendungen zur Untersuchung der Zellgesundheit oder Zellproliferation. Diese Anwendungen nutzen möglicherweise Endpunkt-Assays für das Imaging fluoreszenzmarkierter Nukleine oder erfordern ein robustes Durchlicht-Imaging ungefärbter oder fixierter Zellen.
Die Zellzählung ist bei der Durchführung zahlreicher biologischer Experimente unerlässlich. Für Assays wie die Bestimmung der Toxizität von Wirkstoffverbindungen, Zellproliferation und Inhibition der Zellteilung ist eine genaue Bestimmung der Anzahl oder Dichte der Zellen in einer Vertiefung notwendig.
Automatisierte Zellzählung und Zeitersparnis
Der Beispielarbeitsablauf zeigt, wie ein Benutzer eine Probe einfach in das ImageXpress® Pico Automated Cell Imaging System einlegen kann. Nach einer einfachen Konfiguration der Software zählt das System die Zellen automatisch, ohne dass der Benutzer anwesend sein muss. Dies kann im Vergleich zu traditionellen Methoden wie Fixierung und DAPI-Färbung erhebliche Zeitersparnis bringen. Ein Beispiel hierfür ist die StainFree-Technologie, die im Vergleich zur Fixierung und DAPI-Färbung bis zu 70 Minuten Zeit einsparen kann.
Schnelles Imaging und Analyse mit Multi-Mode Readern
Der SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader mit dem SpectraMax MiniMax Cytometer ermöglicht ein schnelles Imaging und eine schnelle Analyse von Zellen. Dies erlaubt eine detaillierte Beobachtung phänotypischer Veränderungen während Zytotoxizität, Zellproliferation und Proteinexpression.
ImageXpress Pico System: Datenreiche Ergebnisse
Das ImageXpress Pico Automated Cell Imaging System ist ein automatisiertes Zellzählsystem, das Durchlicht- oder Fluoreszenz-Imaging nutzt, um datenreiche Ergebnisse wie Zellkerngröße, gesamten und durchschnittlichen Zellbereich sowie Intensität zu liefern.
Der Zellzyklus: Phasen und Ablauf
Was ist der Zellzyklus?
Der Zellzyklus beschreibt den gesamten Ablauf der Zellteilung, also alle Schritte zwischen dem Beginn einer Zellteilung und dem Beginn der nächsten. Er umfasst zwei Hauptphasen: die Interphase und die M-Phase (Mitose und Zytokinese).
Die Phasen des Zellzyklus:
Die Interphase kann als der Zeitraum zwischen zwei Zellteilungen (M-Phasen) betrachtet werden. Sie setzt sich aus drei Hauptphasen und einer optionalen Ruhephase zusammen: der G1-Phase, der S-Phase und der G2-Phase, sowie der optionalen G0-Phase. Die M-Phase beschreibt die eigentliche Teilung der Zelle.
1. Interphase
Die Interphase ist die Vorbereitungsphase auf die Zellteilung:
- G1-Phase (Gap 1): Dies ist die erste Phase der Interphase. Die Zelle bereitet sich auf die Zellteilung vor und wächst erheblich. Daneben werden große Mengen an RNA und die Vorstufen der DNA (Nukleosidtriphosphate) gebildet. Die Chromosomen bestehen hier nur aus einem Chromatid (1-Chromatid-Chromosomen).
- G0-Phase (Ruhephase): Eine optionale Ruhephase, in der sich die Zelle nicht teilt. Bei Zellen wie Nervenzellen, die sich nie wieder teilen sollen, dauert die G0-Phase dauerhaft an. Andere Zellen können jedoch nur für eine begrenzte Zeit ruhen und bei Bedarf in die G1-Phase zurückkehren.
- S-Phase (Synthese): In dieser Phase verdoppelt die Zelle ihr genetisches Material (DNA) im Zellkern. Aus den Ein-Chromatid-Chromosomen entstehen 2-Chromatid-Chromosomen. Daneben bildet die Zelle Histon-Proteine, die aus dem Zellplasma in den Zellkern gelangen.
- G2-Phase (Gap 2): Die Zelle bereitet sich auf die Mitose vor. Sie wächst durch Flüssigkeitsaufnahme stark an und es werden Mitoseproteine gebildet.
2. M-Phase (Mitose und Zytokinese)
Die M-Phase umfasst die eigentliche Zellteilung:
- Mitose (Kernteilung):
- Prophase: Die Chromosomen spiralisieren sich und nehmen ihre typische Form an.
- Prometaphase: Ein Zwischenschritt, der an die Prophase anschließt.
- Metaphase: Die Chromosomen ordnen sich in der Mitte der Zelle, der sogenannten Äquatorialebene, an.
- Telophase: Nach der Telophase liegen zwei Zellkerne vor, die von Kernhüllen umgeben sind.
- Zytokinese (Zellteilung): Durch eine Trennung des Cytoplasmas wird die gesamte Zelle geteilt. Aus einer Zelle entstehen zwei diploide Tochterzellen. In den Tochterzellen liegt dann jeweils wieder ein diploider Chromosomensatz aus 1-Chromatid-Chromosomen vor.
Regulation des Zellzyklus
Der Körper reguliert den Zellzyklus durch innere und äußere Faktoren. Die inneren Faktoren stellen sicher, dass die einzelnen Phasen ordnungsgemäß ablaufen. Insbesondere Kontrollpunkte sind wichtige Mechanismen innerhalb der Zelle. Sie sorgen dafür, dass der nächste Schritt im Zellzyklus erst beginnt, wenn der vorherige abgeschlossen ist. Ein Beispiel hierfür ist die Zellgröße: Wenn Zellen relativ groß geworden sind und dicht aneinander liegen, kann dies ein Signal für den Zellzyklus sein.